Revista Amazónica y Ciencia y Tecnología, Ene. - Abr. 2019 Volumen 8 (1): 1 - 11
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Impresa ISSN 1390-5600 ● e-ISSN 1390-8049
Gen de control interno VpEf1α en Vasconcellea pubescens (chamburo).
Internal control gene VpEf1α in Vasconcellea pubescens (chamburo).
Tiffany Cevallos-Vilatuña , Karen Alejandra Garzón-Salazar , Fabio Marcelo Idrovo-Espín
1Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas/Ingeniería en Biotecnología, Universidad de Las Américas. Quito. Ecuador.
2Facultad de Ciencias Químicas/Química-Bioquímica y Farmacia, Universidad Central del Ecuador. Quito. Ecuador.
tiffany.cevallos@udla.edu.ec; karen.garzon.salazar@udla.edu.ec; fmidrovo@uce.edu.ec
Resumen
Los genes conocidos como “housekeeping” controlan o regulan procesos celulares básicos y
permanecen activados siempre, independientemente de las condiciones experimentales o entre
las células de diferentes tejidos. Vasconcellea pubescens, es una especie ampliamente distri-
buida en América del Sur y pertenece a la familia Caricaceae al igual que la papaya. En primer
lugar, se diseñaron primers para el gen EF1α en base al genoma de Carica papaya y Arabidop-
sis thaliana. Después, plántulas de V. pubescens se sometieron a tres temperaturas diferentes.
La cuantificación de la expresión relativa del gen se realizó por densitometría. Finalmente, los
fragmentos obtenidos de la RT-PCR se secuenciaron por Secuenciación Sanger de segunda
generación y los análisis bioinformáticos se realizaron con MEGA X mientras que los análisis
estadísticos se realizaron con RCommander. Se obtuvo un fragmento de 173 pb que se deno-
minó VpEF1α. La secuencia de nucleótidos y la traducción a aminoácidos resultaron ser muy
similares al compararlas con secuencias Ef1α conocidas de otras especies vegetales. A partir
de la filogenia realizada con la proteína predicha, VpEF1α se agrupó en un solo clado con
secuencias de álamo, cacao y papaya, todas ellas arbóreas, mientras que Arabidopsis y tabaco
se ubicaron en otro clado. La expresión del gen VpEF1α fue similar en las tres temperaturas
evaluadas cumpliendo el requisito de que no cambie su expresión a diferentes condiciones
experimentales. Se describió de esta forma un gen tipo EF1α en V. pubescens (chamburo) que
podría ser utilizado como gen control interno o housekeeping en estudios futuros.
Palabras clave: Housekeeping gene, V. pubescens, expresión, secuenciación, filogenia.
Abstract
The genes known as "housekeeping" control or regulate basic cellular processes and always
remain activated, regardless of experimental conditions or between cells of different tissues.
Vasconcellea pubescens, a species widely distributed in South America and belongs to the
family Caricaceae just like papaya. First, primers for the EF1α gene were designed on basis of
the genome of Carica papaya and Arabidopsis thaliana. Then, V. pubescens seedlings were
subjected to three different temperatures. The quantification of the relative expression of the
gene was performed by densitometry. Finally, the fragments obtained from RT-PCR were
Recibido: 21 - 12 - 2018 ● Aceptado: 14 - 04 - 2019 ● Publicado: 30 - 04 - 2019
© 2019 Universidad Estatal Amazónica, Puyo, Ecuador.
Disponible gratuitamente en http://revistas.proeditio.com/revistamozonica ● www.uea.edu.ec
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sequenced by second generation Sanger Sequencing and the bioinformatic analysis were
performed with MEGA X while the statistical analysis were performed with RCommander. A
173 bp fragment was obtained which was named VpEF1α. The nucleotide sequence and the
translation to amino acids turned out to be very similar when compared to known EF1α
sequences from other plant species. From the phylogeny performed with the predicted protein,
VpEF1α was grouped in a single clade with sequences of poplar, cocoa and papaya, all of them
arboreal, while Arabidopsis and tobacco were located in another clade. The expression of the
VpEF1α gene was similar in all the three temperatures evaluated, fulfilling the requirement
that it does not change its expression at different experimental conditions. In this way an EF1
α type gene was described in V. pubescens (chamburo) that could be used as an internal control
or housekeeping gene in future studies.
Keywords: Housekeeping gene, V. pubescens, expression, sequencing, phylogeny.
Resumen
Los genes conocidos como “housekeeping” controlan o regulan procesos celulares básicos y
permanecen activados siempre, independientemente de las condiciones experimentales o entre
las células de diferentes tejidos. Vasconcellea pubescens, es una especie ampliamente distri-
buida en América del Sur y pertenece a la familia Caricaceae al igual que la papaya. En primer
lugar, se diseñaron primers para el gen EF1α en base al genoma de Carica papaya y Arabidop-
sis thaliana. Después, plántulas de V. pubescens se sometieron a tres temperaturas diferentes.
La cuantificación de la expresión relativa del gen se realizó por densitometría. Finalmente, los
fragmentos obtenidos de la RT-PCR se secuenciaron por Secuenciación Sanger de segunda
generación y los análisis bioinformáticos se realizaron con MEGA X mientras que los análisis
estadísticos se realizaron con RCommander. Se obtuvo un fragmento de 173 pb que se deno-
minó VpEF1α. La secuencia de nucleótidos y la traducción a aminoácidos resultaron ser muy
similares al compararlas con secuencias Ef1α conocidas de otras especies vegetales. A partir
de la filogenia realizada con la proteína predicha, VpEF1α se agrupó en un solo clado con
secuencias de álamo, cacao y papaya, todas ellas arbóreas, mientras que Arabidopsis y tabaco
se ubicaron en otro clado. La expresión del gen VpEF1α fue similar en las tres temperaturas
evaluadas cumpliendo el requisito de que no cambie su expresión a diferentes condiciones
experimentales. Se describió de esta forma un gen tipo EF1α en V. pubescens (chamburo) que
podría ser utilizado como gen control interno o housekeeping en estudios futuros.
Palabras clave: Housekeeping gene, V. pubescens, expresión, secuenciación, filogenia.
Abstract
The genes known as "housekeeping" control or regulate basic cellular processes and always
remain activated, regardless of experimental conditions or between cells of different tissues.
Vasconcellea pubescens, a species widely distributed in South America and belongs to the
family Caricaceae just like papaya. First, primers for the EF1α gene were designed on basis of
the genome of Carica papaya and Arabidopsis thaliana. Then, V. pubescens seedlings were
subjected to three different temperatures. The quantification of the relative expression of the
gene was performed by densitometry. Finally, the fragments obtained from RT-PCR were
Gen de control interno VpEf1α en Vasconcellea pubescens (chamburo).
Tiffany Giselle et al.
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sequenced by second generation Sanger Sequencing and the bioinformatic analysis were
performed with MEGA X while the statistical analysis were performed with RCommander. A
173 bp fragment was obtained which was named VpEF1α. The nucleotide sequence and the
translation to amino acids turned out to be very similar when compared to known EF1α
sequences from other plant species. From the phylogeny performed with the predicted protein,
VpEF1α was grouped in a single clade with sequences of poplar, cocoa and papaya, all of them
arboreal, while Arabidopsis and tobacco were located in another clade. The expression of the
VpEF1α gene was similar in all the three temperatures evaluated, fulfilling the requirement
that it does not change its expression at different experimental conditions. In this way an EF1
α type gene was described in V. pubescens (chamburo) that could be used as an internal control
or housekeeping gene in future studies.
Keywords: Housekeeping gene, V. pubescens, expression, sequencing, phylogeny.
Introducción
Los genes de control interno o genes de
referencia conocidos como “housekeeping”,
controlan y regulan procesos celulares
básicos como: el metabolismo primario o el
mantenimiento estructural (Luo et al., 2014),
debido a esto su nivel de expresión bajo
distintas condiciones permanece constante,
por lo que se asume que este tipo de genes no
se ven afectados por parámetros experimen-
tales o entre células de diferentes tejidos
(Zhu et al., 2012). Los genes que cumplen
con esta característica son candidatos apro-
piados para actuar como genes de control
interno. Caso contrario, una expresión
diferente del gen control bajo diferentes
tratamientos, daría lugar a resultados
erróneos al compararse con un gen de interés
en estudio (Jain et al., 2006; Turabelidze et
al., 2010) La identificación de estos genes,
incrementa la comprensión de características
estructurales de las células, por lo tanto son
herramientas fundamentales para estandari-
zar varias aplicaciones biotecnológicas y
estudios genómicos (Eisenberg & Levanon,
2013).
Dependiendo de la especie en estudio y de
los tejidos utilizados, los genes de control
interno frecuentemente usados en plantas
son: Gapdh (del inglés glyceraldehy-
de-3-phosphate dehydrogenase) (Barsalo-
bres-Cavallari et al., 2009), RL5 (que codifi-
ca para la proteína L5 de la sub unidad
ribosomal 60S), RL28 (que codifica para la
proteína L28 de la sub unidad ribosomal
60S), COX1 (del inglés cytochrome C
oxidase subunit 1) y β-actina. Sin embargo,
la estabilidad y la capacidad de algunos
genes mencionados (ACT, GAPDH) han
sido cuestionadas en algunos estudios debido
a que exhibieron perfiles de expresión varia-
ble bajo diferentes condiciones (Suzuki et
al., 2000; Tong et al., 2009). Por otro lado,
existen estudios puntuales donde indican que
el gen EF1α (del inglés Elongation Factor-1
α), es un gen de control interno recomendado
para la normalización en la expresión espa-
cial y temporal en varios análisis abióticos y
bióticos (Li et al., 2010; Løvdal & Lillo,
2009; Zhu et al., 2012). Por lo que se requie-
re una selección adecuada de genes de
referencia en diferentes sistemas biológicos.
Se ha reportado en la planta modelo: Arabi-
dopsis thaliana, la presencia de 4 genes que
codifican para proteínas EF1α, designadas
como A1, A2, A3 y A4 (Axelos et al., 1989).
Estas variantes proteicas altamente conser-
vadas cumplen funciones diversas en Arabi-
dopsis, por ejemplo, actúan tanto en la
biosíntesis (Andersen et al., 2003), exporta-
ción nuclear así como también en la degrada-
ción de proteínas (Gonen et al., 1994),
poseen actividad de chaperona (Suhandono
et al., 2014), intervienen en el metabolismo
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primario y el mantenimiento de la estructura
celular (Ohta et al., 1990). Además, están
involucradas en la activación de la enzima
fosfatidilinositol 4-kinase (componente
esencial en diversas vías de señalización), o
en la unión/interacción con la calmodulina
(Numata et al., 2000; Ransom-Hodgkins,
2009) y otras funciones interesantes como su
participación en infecciones y patologías
como la replicación viral (Yamaji et al.,
2010). Finalmente EF1α es la segunda
proteína más abundante después de la actina
(Condeelis, 1995). Los distintos roles que
cumple EF1α en procesos celulares básicos
hacen que los genes que codifican para la
proteína, sean elegidos como genes de
referencia o genes control.
El miembro más conocido e importante de la
familia Caricaceae es la papaya (Carica
papaya), cultivada en regiones tropicales y
subtropicales. Su centro de origen probable
es Centroamérica, y las mayores zonas
productoras al rededor del mundo son Brasil,
Nigeria, India, México e Indonesia (Ploetz &
Ploetz, 2018.). Desde el punto de vista
biotecnológico también es un cultivar impor-
tante ya que es el primer frutal de consumo
humano que ha sido modificado genética-
mente (Gonsalves, 2004) para conferirle
resistencia al virus de la mancha anular de la
papaya (de sus siglas en Inglés, Papaya Ring
Spot Virus o PRSV) y cuyo genoma ha sido
completamente secuenciado (Ming et al.,
2008). Es por esto que se considera un siste-
ma prometedor en la investigación, debido a
que su genoma es relativamente pequeño,
con tan solo 372 megabases permite al inves-
tigador un mejor estudio de los genes, su
aislamiento y mutación. Una comparación de
su genoma con el de Arabidopsis arroja una
nueva percepción sobre la historia evolutiva
de la papaya. Se conoce que segmentos
individuales del genoma de Arabidopsis
corresponden a solo un segmento de papaya,
indicando que no hubo duplicación del
genoma en el linaje de la caricácea desde su
divergencia de Arabidopsis cerca de 72
millones de años atrás (Ming et al., 2008).
Para Carica papaya, Zhu et al., (2012)
evaluaron 21 genes que podían ser conside-
rados como genes de referencia bajo diferen-
tes condiciones experimentales (tejidos de
distintos órganos, temperaturas de almacena-
miento, etapas de desarrollo, maduración,
modificación en la atmósfera, estrés biótico
y tratamiento hormonal). Entre estos genes
se encontró que EF1α presentó la expresión
más estable en las diferentes condiciones
planteadas, a comparación con los demás
genes (Actin, Gadph, 18S rRNA, entre
otros). Es así, que se escogió a EF1α como
un representante adecuado para actuar como
gen de control interno (Zhu et al., 2012).
Vasconcellea, comúnmente referida como
papaya de montaña, está ampliamente
relacionada con la papaya común (Carica
papaya). Es el género que posee la mayor
cantidad de miembros con 21 especies de las
35 conocidas (Scheldeman et al., 2006). La
separación entre los géneros Carica y
Vasconcellea se remonta hace 27 millones de
años durante el oligoceno (Antunes et al.,
2012) . Se ha observado que las variedades
vegetales silvestres poseen características de
interés, como genes asociados a resistencia a
virus, hongos, tolerancia a estrés por altas o
bajas temperaturas (Bolger et al., 2014;
d’Eeckenbrugge et al., 2014) o sustancias
químicas útiles para la industria, medicina o
beneficiosas para la nutrición (Duarte &
Paull, 2015; Scheldeman et al., 2006). A
pesar de esto en la familia Caricaceae, tan
solo la papaya ha captado la atención princi-
pal en lo que se refiere a la investigación
biotecnológica, dejando de lado a otras espe-
cies que podrían ser de extrema utilidad
como Vasconcellea.
El Ecuador posee 16 de las 21 especies de
Vasconcellea conocidas (Scheldeman et al.,
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2006). Entre ellas, Vasconcellea pubescens,
también conocida como chamburo (este
último como término propio de Ecuador), es
un árbol nativo de la regiones subtropicales
de Sur América, en especial de las regiones
altas de Colombia y Ecuador (Gaete-East-
man et al., 2009). Debido a que V. pubescens
(y otros miembros del género Vasconcellea)
sigue siendo una especie silvestre escasa-
mente estudiada, podría tener genes de
interés que las variedades comerciales como
la papaya han perdido por efecto de la
domesticación. Sin embargo el estudio de
genes control, resulta ser la base para dar
inicio a investigaciones futuras en expresión
de genes de interés, por esta razón el objetivo
de la presente investigación fue identificar y
reportar genes EF1α en V. pubescens que
podrían utilizarse como genes de control
interno en aplicaciones futuras de esta espe-
cie silvestre.
Materiales y métodos
Los oligonucleótidos; Forward (TTC ACC
CTT GGT GTC AAG C); Reverse (TAC
CAG TCA AGG TTG GTG G) se diseñaron
a partir de la secuencia genómica conocida
de EF1α de papaya para ser utilizados en V.
pubescens. Para esto se utilizó el software
NCBI/Primer-Blast y OligoAnalyser 3.1.
Plántulas de V. pubescens se sometieron a
tres diferentes temperaturas (25, 45 y 55 °C)
con la finalidad de evaluar si nuestro gen
mostraba una expresión similar, de forma
independiente a la temperatura. La extrac-
ción total del RNA de V. pubescens se realizó
mediante TRIZOL de acuerdo con el proto-
colo descrito por (Chomczynski & Sacchi,
1987) con modificaciones. Posteriormente
para el tratamiento con ADNasa se utilizó el
Kit DNase I, Amplification Grade (Invitro-
genTM), según las instrucciones del fabri-
cante.
Para el gen EF1α se armó un total de 10
reacciones incluyendo un control negativo
con un volumen final de 25 µl por reacción.
Cada reacción contenía 2,2 µl de ARN total
tratado con ADNasa equivalente a una
concentración de 200 ŋg. La RT-PCR se
armó de la siguiente manera: síntesis de
ADNc (55 °C, 20 min), pre-desnaturaliza-
ción (1 ciclo, 94°C, 2 min), desnaturaliza-
ción (94°C, 15 seg), alineamiento (35 ciclos,
60 °C, 30 seg) y extensión final (1 ciclo,
72°C, 5 min).
Posterior a la RT-PCR se realizó un gel de
electroforesis al 2%. La expresión relativa de
EF1α fue cuantificada utilizando el software
Image LabTM 5.2.1 (Bio Rad) por densito-
metría. El fragmento obtenido VpEF1α se
secuenció en los laboratorios de la Universi-
dad de las Américas Quito. Ecuador, a través
de una secuenciación de segunda generación
por el método de Sanger. Para el alineamien-
to se utilizó secuencias reportadas de EF1α
de 5 especies: C. papaya (número de acce-
sión JQ678770 descrito por Zhu et al., 2012),
A. thaliana (número de accesión
AT1G07920.1), Theobroma cacao (número
de accesión XM_007009689), Populus
trichocarpa (número de accesión
XM_002316315), Nicotiana tabacum
(número de accesión AF120093) finalmente
se utilizó la secuencia que codifica para la
sub unidad RPN2b del proteasoma 26S
(número de accesión AY242527) como
outgroup. Se realizó la traducción a aminoá-
cidos de las secuencias y se obtuvo el árbol
filogenético mediante MEGA X a partir de
las secuencias descritas. Adicionalmente, se
generó la representación gráfica LOGO a
partir de la plataforma en línea WebLogo,
versión 2.8.2. El análisis estadístico de la
intensidad de las bandas (densitometría) se
realizó con el paquete RCommander.
Resultados y discusión
A la secuencia obtenida, propia de V. pubes-
cens se denominó VpEF1α. En la Figura 1
del alineamiento de nucleótidos se observó
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que los fragmentos son similares entre sí
(salvo variaciones puntuales), que podrían
explicarse como propias de la planta. De
forma interesante se observó que el porcenta-
je de identidad (PI) de VpEF1α era el mismo
al compararse con CpEF1α y PtEF1α con un
valor de 91.33% mientras que, entre CpEF1α
y PtEF1α el PI fue de 90.17% y entre CpEF1
α y TcEF1α 92.49%, esto quiere decir que las
secuencias tipo EF1α de papaya y cacao, se
parecen más entre sí (lo que se aprecia
también más adelante en el árbol filogenéti-
co). En este estudio, los porcentajes de iden-
tidad de las secuencias estudiadas son altos,
superan en todos los casos el 84%. De forma
general este efecto es el mismo en otras espe-
cies vegetales y ha permanecido constante
durante la historia evolutiva de las mismas
evidenciando la importancia de los genes
EF1α en estos organismos. Los genes que
codifican para Elongation Factor son
producto de una antigua duplicación de
genes, que podría ser incluso anterior a la
divergencia de todos los linajes de organis-
mos existentes (Baldauf et al., 1996). Según
Baldauf (1996), genes que codifican para EF
están presentes ampliamente en los tres
dominios: bacterias, eucariotas y arqueas.
Siendo así que los autores propusieron que el
origen de los organismos eucariotas procede
de las arqueas, todo esto basado en secuen-
cias EF. El hecho de que las secuencias se
mantengan tan conservadas y similares
indica que ya estaban presentes en LUCA
(del inglés Last Universal Common Ances-
tor) (Leipe et al., 2002)
Figura 1. Alineamiento de nucleótidos de secuencias EF1α seleccionadas, los bloques negros representan que las
secuencias son idénticas, los bloques blancos indican variación de nucleótidos.
Elaborado por: Cevallos, T. (2018).
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Figura 2. Análisis filogenético molecular de secuencias de aminoácidos tipo EF1α de especies seleccionadas y
VpEF1α.
Elaborado por: Cevallos, T. (2018).
A partir de las secuencias de nucleótidos traducidas a aminoácidos, se obtuvo cadenas peptídi-
cas de 56 aa (aminoácidos) de longitud. El árbol filogenético (Figura 2) indicó que todas las
secuencias compartieron un ancestro común, por lo tanto, están relacionadas entre sí.
La secuencia proteica de VpEF1α se agrupó
directamente con la secuencias de álamo,
cacao y papaya formando un solo clado
representado por I, este resultado es consis-
tente con el hecho de que C. papaya guarda
mayor relación con especies arbóreas al
compartir un mayor números de genes
relacionados con la expansión celular (Ming,
2018) y adicionalmente con que los genes de
tipo EF1α están relacionados con el creci-
miento y desarrollo (Liu et al., 2016). A
pesar de que A. thaliana es una herbácea
comparten el mismo orden (Brassicales) que
V. pubescens y C. papaya lo que explicaría
que comparta un ancestro común con el
clado I pero no se encuentre dentro de este
clado. Por otra parte, N. tabacum pertenece a
la familia Solanaceae con orden Solanales,
diferencias que podrían explicar que aparez-
ca sola, como un clado diferente.
El diseño de WebLogo obtenido a partir de
las secuencias proteicas, indicó un elemento
del GTP-binding domain (Figura 3). Las
denominadas proteínas de unión a GTP (del
inglés GTP-binding proteins) o proteínas G
tienen la habilidad de hidrolizar la guanosina
trifosfato en guanosina difosfato (y también
el efecto contrario) y están involucradas en
la traducción de mRNA a proteínas, en el
crecimiento celular y proliferación, en la
transducción de señales, tráfico membranal
y secreción, organización y movimiento
celular. Entre estas proteínas, se encuentran
las del tipo EF1α.}
En las secuencias de las proteínas G se reco-
nocen tres elementos conservados con
secuencias consenso GXXXXXGK, DXXG
y NKXD (X puede ser cualquier amino
ácido) espaciadas entre sí entre 40 a 80
amino ácidos (Dever et al., 1987), una parte
del tercer elemento es justamente lo que se
logró identificar en la secuencia parcial obte-
nida.
Figura 3. Gráfica WebLogo de las secuencias proteicas EF1α, la flecha gris representa una parte del elemento
NKXD del dominio de unión GTP. El espiral representa una hélice y la flecha negra una hoja β plegada.
Elaborado por: Cevallos, T. (2018).
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Figura 4. Expresión relativa del gen VpEF1α a diferentes temperaturas, en la parte superior de la figura se aprecian
bandas correspondientes a los productos de RT-PCR. Las letras iguales indican que no hay diferencia significativa
con p< 0.01.
Elaborado por: Cevallos, T. (2018).
A través de una predicción proteica realizada
con JPred4 (Drozdetskiy et al., 2015) se
logró determinar la presencia de estructuras
secundarias en las secuencia EF1α que
hemos detallado en la misma ilustración de
WebLogo. Adicionalmente, una cadena de
polipéptido de 17 aa con una estructura de
tipo α-hélice y otra de 3 aa tipo lámina-β fue
identificada.
Todo lo que se describió anteriormente se
realizó con la finalidad de ilustrar que,
aunque se trataba de una secuencia de
nucleótidos corta, pudimos aportar con infor-
mación inédita sobre VpEF1α.
El gel de electroforesis (Figura 4) y el análi-
sis estadístico de la expresión relativa de
VpEF1α, no indicó ninguna diferencia signi-
ficativa de la intensidad de las bandas en
cada temperatura (25, 45, 55 °C). Por lo
tanto, estadísticamente la intensidad fue la
misma en las tres temperaturas establecidas.
La estabilidad de un gen control bajo
diferentes condiciones de estrés debe ser
constante, a su vez, los genes de control
interno adecuados varían entre cada planta y
tejido de la misma. Estudios en melocotón
cuestionaron la estabilidad de genes de
referencia comúnmente conocidos como
ARN ribosómico 18S, β-actina (ACT) la
gliceraldehídos-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH). Sugieren que estos genes se
deben utilizar con precaución como contro-
les internos, ya que mostraron diferentes
comportamientos en diferentes condiciones
de experimento. La razón se sustenta en que
estos genes no solo participan en el metabo-
lismo celular sino en otros procesos celulares
(Suzuki et al., 2000).
Si bien ya existe un estudio en donde EF1α,
ha sido utilizado como gen control en V.
pubescens bajo estrés abiótico (Gaete-East-
man et al., 2009), los autores no presentan
información de la secuencia del producto
amplificado ni la caracterizaron. Aun así, el
estudio de Gaete (2009) demuestra la estabi-
lidad de esta secuencia putativa EF1α como
control interno incluso durante una PCR en
tiempo real. Del mismo modo, EF1α fue
utilizado como housekeeping durante un
estudio realizado en C. papaya, comproban-
do así la expresión constante del gen bajo
condiciones abióticas (Chan-León et al.,
2017). Adicionalmente, diferentes estudios,
han comprobado que el mismo resulta ser
estable bajo estrés biótico en tejidos de hoja
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y raíz de manzana (Malus domestica)
(Kumar & Singh, 2015). De igual manera,
EF1α resultó ser el gen de control interno
con mayor estabilidad para la prueba de
estrés biótico; tizón tardío de la papa (Sola-
num tuberosum). Este mismo estudio com-
prueba la estabilidad del gen bajo estrés
abiótico como el frío y estrés salino (Nicot et
al., 2005). De igual manera, EF1α también
resultó ser un gen estable, bajo estrés abióti-
co (calor, frío, hormonas, y deshidratación),
así como, bajo estrés biótico (Pseudopero-
nospora cubensis) en pepino (Cucumis
sativus) (Joseph et al., 2018). A pesar que,
EF1α no ha sido utilizado como gen de
control bajo estrés biótico en V. pubescens ni
C. papaya, este sí ha sido utilizado como gen
de control de estrés abiótico en estas especies
(Gaete-Eastman et al., 2009; Zhu et al.,
2012; Chan-León et al., 2017).
Conclusiones
Existe al menos una secuencia génica tipo
EF1α para V. pubescens (chamburo), la
secuencia de nucleótidos (y su traducción
proteica) presentan características similares
a secuencias EF1α conocidas en otras espe-
cies vegetales y respondió en este estudio in
vivo, de forma constitutiva y homogénea
como un prometedor gen de control interno
bajo condiciones de estrés por calor. Se
requieren más ensayos para determinar el
comportamiento de este gen bajo otras
condiciones experimentales abióticas y bióti-
cas. Al no existir estudios de estrés biótico en
V. pubescens, EF1α podría ser considerado
como un gen de control interno prometedor
en este tipo de investigación. Por lo que se
recomienda realizar pruebas bajo este tipo de
condiciones a la que la planta esté normal-
mente expuesta. Finalmente, se demostró la
utilidad de este gen como control interno en
V. pubescens bajo estrés abiótico en plántu-
las sometidas a temperatura.
Agradecimientos
Al Ministerio del Ambiente del Ecuador
(MAE) por los permisos concedidos
(MAE-DNB-CM-2017-0063), a Rosa
Vilatuña, por su apoyo incondicional y
consejos. Este trabajo fue financiado por la
UDLA (proyecto INV/F/PPI/1/0814).
Literatura Citada
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