Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas para la
Determinación de Flavonoides Totales, Basada en Quercetina, en las Hojas de
Psidium guajava L.
William Ortíz Fernández¹, Yoel Aguilera¹, María Elisa Jorge Rodríguez², Dorys Magaly
Guzmán Mayancha³, Hugarita Maribel Cobo Salinas³, Luis Ramón Bravo Sánchez³.
¹Instituto Tecnológico de Tijuana. México
²Universidad Central de Las Villas. Cuba
³Universidad Estatal Amazónica. Ecuador
lbravo@uea.edu.ec
Resumen
Se analizaron los sólidos pulverulentos obtenidos de las hojas de Psidium guaja-
va L. (guayaba), para lo cual se realizó una extracción por decocción a reflujo
con acetona, una posterior hidrólisis ácida y finalmente la extracción líquido –
líquido con acetato de etilo. Los flavonoides se identificaron mediante reaccio-
nes colorimétricas en los extractos totales y previa separación por cromatografía
en capa fina. Para la cuantificación se empleó la espectrofotometría ultravioleta
- visible como método analítico para la determinación de flavonoides totales
respecto al metabolito quercetina; se desarrolló un método directo y otro indirec-
to y ambos fueron validados sobre la base del cumplimiento de los parámetros
de desempeño analítico: Linealidad, Precisión, Exactitud y Sensibilidad. El
contenido de flavonoides totales en la muestra de los sólidos pulverulentos de
las hojas de Psidium guajava L. fue de 1,018 ± 0,080 % para el método directo
y un 0,936 ± 0,090 % para el método indirecto. Ambos valores fueron relativa-
mente cercanos; para el método indirecto la concentración fue ligeramente
menor porque, bajo las condiciones de este análisis, la absorbancia está menos
influida por sustancias interferentes. Los dos métodos espectrofotométricos
pueden ser adecuados para llevar a cabo la cuantificación de flavonoides en
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3- (Pag 276-288)
Recibido: 24-03-2016
Recibido en forma corregida: 12-12-2016
Aprobado: 19-12-2016
277
Abstract
Pulverulent solids obtained from Psidium guajava L. (guava) leaves were analy-
zed. This was performed through a decoction extraction with acetone refluxing
and an acid hydrolysis. Finally, a liquid – liquid extraction was performed using
ethyl acetate. After being separated by a thin layer chromatography, flavonoids
were identified by colorimetric reactions in total extracts. Ultraviolet-visible
spectrophotometry was used for the quantification process as an analytical
method for the determination of total flavonoids. It was developed as both a
direct and an indirect method, in respect to the quercetin metabolite and both
were validated on the basis of completion with the analytical performance para-
meters: linearity, precision, accuracy and sensitivity. The total flavonoid content
in the sample of pulverulent solids from Psidium guajava L. leaves was 0.080 ±
1.01% through the direct method and 0.936 ± 0.090% for the indirect method.
Both values were relatively close. The fact that the concentration obtained by the
indirect method was slightly smaller was because, under the conditions of this
analysis, the absorbance is less influenced of any interfering substances. The
two spectrophotometric methods can be suitable to perform the quantification of
flavonoids in Psidium guajava L. leaves.
Key Words: polyphenols, Psidium guajava L., flavonoids, spectrophotometry,
validation.
hojas de guayaba.
Palabras Claves: polifenoles, Psidium guajava L., flavonoides, quercetina,
espectrofotometría, validación.
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
278
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Ortíz et al
279
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
280
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Ortíz et al
281
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
282
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Ortíz et al
283
Introducción
Desde tiempos remotos de la
humanidad, la medicina siempre ha
sido considerada la ciencia principal.
Muchos estudiosos indican que los
inicios de la medicina tradicional
herbolaria se remontan al propio
surgimiento de la Humanidad
(Euskaltegi, 2001). Las plantas medi-
cinales han sido utilizadas ancestral-
mente como medios curativos o para
aliviar padecimientos y son un
conjunto de especies vegetales que
poseen metabolitos biológicamente
activos (Wu P, 2000).
La guayaba es conocida como la man-
zana del hombre pobre de los trópicos
y tiene una historia larga de uso tradi-
cional que ha sido validada por la
investigación científica. Debido a su
extenso uso tradicional y a un conjun-
to de propiedades que son las que le
confieren importancia, esta planta ha
sido empleada para tratar una gran
diversidad de enfermedades. Algunas
de las principales acciones descritas
son: antimicrobiana, antiinflamatoria,
antioxidante, antiespasmódica, antiul-
cerosa, hipoglucemiante y antidiarrei-
ca, para lo cual se ha empleado casi
siempre la infusión o decocción de
sus hojas. Además de su uso tradicio-
nal, se han desarrollado un conjunto
de preparados como son: extractos
fluidos, elíxires, jarabes y tinturas
para potenciar su uso en las distintas
enfermedades que puedan curar o
aliviar (Qian, 2004; Wang, 2005;
Prabu, 2006).
Las propiedades curativas de las hojas
de guayaba se deben a los metabolitos
que se encuentran en ellas, tales
como: taninos, fenoles, triterpenos,
aceites esenciales, saponinas,
vitaminas, ácidos grasos y
flavonoides, dentro de los cuales se
encuentra la quercetina que es a la que
se le atribuyen varias de sus
propiedades (Kuklinski, 2000).
Los flavonoides son
metabolitos ampliamente distribuidos
en el reino vegetal; pueden mejorar
los estados de diarrea aguda y crónica
a través de la inhibición de la
secreción y motilidad intestinal y
también ser muy útiles en la
reducción del daño inflamatorio
crónico en el intestino, protegiéndolo
del estrés oxidativo y preservando la
función de la mucosa (Lozoya, 2002).
Para el desarrollo industrial de
preparados medicinales a partir de las
hojas de guayaba es imprescindible
identificar y cuantificar sus
metabolitos principales con vistas a
establecer criterios de dosificación y
poder llevar a cabo el control químico
de su calidad. Con este propósito se
pueden emplear diferentes técnicas de
análisis como: cromatografía en capa
fina (CCF), de gases (CG) y de
líquidos de alta eficacia (HPLC), así
como la espectrofotometría
ultravioleta visible (UV-Vis), la cual
ha sido una de las que más
ampliamente se ha utilizado por su
sencillez y su bajo costo
(Kostennikova, 1997; Gutiérrez,
2003).
Finalmente es importante
recalcar que todas las técnicas
analíticas que se desarrollen para ser
aplicadas en el control de productos
farmacéuticos deben ser
adecuadamente validadas con este
propósito (European Pharmacopeia,
2016).
Materiales y Métodos.
Material vegetal
Se emplearon hojas
consideradas adultas (≥11 cm de
longitud y ≥4 cm de ancho) de
Psidium guajava L. Se pesó alrededor
de 1 kg del material vegetal
recolectado, el cual fue desecado a
una temperatura de 105 °C hasta peso
constante. Las hojas secas fueron
molinadas y pasadas a través de un
tamiz de 0,5 mm, con el objetivo de
buscar un tamaño de partícula
uniforme (European Pharmacopeia,
2016).
A partir de la droga cruda
obtenida se prepararon las muestras
para el desarrollar y validar las dos
técnicas espectrofotométricas (directa
e indirecta) para la cuantificación de
flavonoides totales expresados como
quercetina.
Reactivos
Los reactivos y disolventes
empleados en este estudio fueron:
Metanol (puro para HPLC)
UNI-CHEM, Acetona, p.a.
UNI-CHEM, Ácido acético glacial,
p.a. UNI-CHEM, Acetato de etilo,
p.a. UNI-CHEM, Ácido fórmico, p.a.
Reachim, Ácido Clorhídrico,
Panreac, Etanol comercial, Hexamina
(Hexametiltetramina), p.s. Reachim,
Ácido fórmico, p.s. Reachim, Sulfato
de sodio anhidro, UNI-CHEM,
Tricloruro de aluminio, p.s. Reachim,
Tolueno, p.a. UNI-CHEM,
Diclorometano, p.a. UNI-CHEM.
Método de análisis cualitativo
La identificación de
flavonoides se realizó mediante una
reacción colorimétrica con tricloruro
de aluminio, o sea, se tomaron 2 mL
de la muestra problema disuelta en
acetato de etilo y se le adicionó 1 mL
de tricloruro de aluminio (AlCl
3):
(disolución preparada con 500 mg de
AlCl
3 en 25 mL de una disolución de
ácido acético al 5% en metanol). Si se
obtiene una coloración amarilla, en
este caso, la prueba es positiva a la
presencia de flavonoides.
Otro método de identificación
empleado fue la cromatografía en
capa fina (CCF), bajo las siguientes
condiciones:
Como fase móvil se empleó
una mezcla diclorometano-metanol
(80:20) y como fase estacionaria gel
de sílice (F 254) de dimensiones:
20x20 cm y 0,2 mm de espesor. Como
revelador se usó la disolución de
tricloruro de aluminio antes
mencionada; con este fin se utilizó
también la lámpara ultravioleta.
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se pesó 1,5 mg de quercetina
y se disolvió en acetato de etilo, con
ayuda de un baño ultrasónico, se
enrasó en un matraz aforado de 10 mL
con el mismo disolvente.
A partir de este patrón (150 mg/L) se
prepararon las disoluciones de la
curva de calibración en el intervalo de
3 a 9 mg/L.
Preparación de la muestra
La extracción del concentrado
de flavonoides se realizó utilizando la
metodología descrita en la literatura
oficial (European Pharmacopeia,
2016), o sea, pesar 200 mg del sólido
pulverulento de Psidium guajava L.,
colocar en un balón de 250 mL,
conjuntamente con 20 mL de acetona,
posteriormente adicionar 1 mL de
hexamina (5g/L) y 2 mL de ácido
clorhídrico concentrado. Extraer a
reflujo durante 30 minutos, filtrar con
la ayuda de un algodón y extraer
nuevamente a reflujo con 20 mL de
acetona por 10 minutos. Reunir los
filtrados en un matraz aforado de 100
mL y completar el volumen con
acetona.
Del extracto obtenido se
tomaron 20 mL, se transfirieron a un
embudo separador con 20 mL de agua
destilada y se realizaron varias
extracciones con acetato de etilo (15,
10 y 10 mL). Los extractos orgánicos
se colocaron en una vaso de
precipitado y se le adicionaron 10 g de
sulfato de sodio anhidro con el
objetivo de eliminar el agua en el
medio; a continuación se filtró, se
vertió en un matraz aforado de 50 mL
y se enrasó con acetato de etilo. A la
muestra obtenida se le midió la
absorbancia a 370 nm contra acetato
de etilo
Método de análisis cuantitativo
directo
Preparación del patrón
Se preparó una disolución
madre de 150 mg/L. De dicha
disolución se tomó una alícuota de 0,1
mL, se transfirió a un matraz aforado
de 5 mL y se le adicionó 0,2 mL de
una disolución de tricloruro de
aluminio preparada al 2% con una
disolución de ácido acético en
metanol al 5%. A continuación se
completó el volumen con la
disolución de ácido acético en
metanol al 5%.
Preparación de la muestra:
La preparación de la muestra
coincide con lo descrito
anteriormente. La absorbancia se lee
inmediatamente a 425 nm contra
blanco.
Cálculos
Se realizó por el método de la curva
de calibración en el intervalo de 1,5 a
7,5 mg/L.
Validación de los métodos
desarrollados.
Se evaluaron algunos
parámetros de desempeño (European
Pharmacopeia, 2016). El
procesamiento de los resultados se
realizó utilizando las posibilidades de
cálculo estadístico del Microsoft
Office Excel, 2003.
Linealidad
Se prepararon cinco
disoluciones del patrón de quercetina,
por triplicado, de concentraciones:
3.0, 4.5, 6.0, 7.5 y 9.0 mg/L, para la
técnica directa y para la indirecta las
concentraciones: 1.5, 3.0, 4.5, 6.0 y
7.5 mg/L. Se midieron las
absorbancias y se construyeron las
curvas de calibración. Se efectuó un
análisis de regresión lineal y se
calcularon los coeficientes de
correlación (r) y de determinación
(r2), el coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CVf), las
pendientes, interceptos y su
significación.
Precisión
Repetibilidad:
Se realizaron cinco réplicas,
por el mismo analista, el mismo día,
con el mismo instrumento y se calculó
la desviación estándar relativa.
Precisión intermedia:
Se analizaron cinco muestras
por triplicado y por dos analistas, dos
días diferentes y en dos instrumentos
diferentes. Se calculó la desviación
estándar relativa y se tuvieron en
cuenta, además, los resultados del
cálculo de la C de Cochran y H de
Horwitz.
Exactitud
Se utilizó el método de
adición de estándar. Se partió de una
muestra, preparada según lo descrito
con anterioridad, de la que se tomaron
tres alícuotas iguales de 2,5 mL. Se
les añadieron cantidades crecientes de
patrón correspondiente a 3.0, 4.5 y 6.0
mg/L de quercetina, para el método
directo.
Para el método indirecto se
tomaron tres alícuotas de 2 mL de la
muestra, se le adicionaron
concentraciones crecientes de patrón,
correspondientes a 1.5, 3.0 y 4.5 mg/L
de patrón de quercetina. Estas
adiciones sucesivas se realizaron para
la cuantificación de flavonoides sobre
la base del estándar añadido. Los
resultados de la exactitud se
expresaron como porcentaje de
recobro (R).
Sensibilidad
Como criterio de la
sensibilidad se tomó el valor de la
pendiente de la curva, así como los
límites de detección (LD) y de
cuantificación (LC) (Eurachem,
1998). Los cálculos se realizaron por
el criterio de 3S y 10S,
respectivamente, es decir el límite de
detección como la concentración de
analito que produce una señal igual a
tres veces la desviación estándar del
blanco (criterio 3σ de la IUPAC) bajo
las condiciones experimentales
óptimas. El límite de cuantificación se
calculó como la concentración de
analito que produce una señal igual a
diez veces la desviación estándar del
blanco (Thompson M., col., 1999)
bajo las condiciones experimentales
óptimas.
Especificidad
Los métodos desarrollados y
validados se caracterizan por ser
inespecíficos, al tratarse de
determinaciones
espectrofotométricas,
independientemente de que se puede
lograr una mayor especificidad en la
determinación a través del método
indirecto.
Resultados y Discusión
Análisis cualitativo de
flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
La identificación colorimétri-
ca resultó positiva a la presencia de
flavonoides, ya que la reacción con el
tricloruro de aluminio evidenció una
coloración amarilla (European Phar-
macopeia, 2016).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Además de las reacciones que
producen compuestos coloreados, la
cromatografía en capa delgada es otro
de los ensayos comúnmente
utilizados para el control cualitativo
de los metabolitos activos de origen
vegetal pues son métodos de
separación que permiten lograr una
mayor especificidad en los análisis.
Teniendo en cuenta lo anterior puede
inferirse que la mancha observada en
la muestra se debe a la presencia de
quercetina en la misma, la cual es el
único metabolito, tal vez por su abun-
dancia relativa, detectada bajo las
condiciones experimentales seleccio-
nadas.
Se observó el comportamiento espec-
tral (Figura 1) una vez desarrollado el
color con tricloruro de aluminio (a) y
sin desarrollar (b).
Patrón Muestra
0,66±0,03 0,64±0,03
Para la identificación se tomó
como referencia un patrón de
quercetina, teniéndose en cuenta su
color al revelado específico con el
tricloruro de aluminio y el cálculo y
análisis comparativo de los valores de
Rf (tabla 1).
Tabla 1. Valores de Rf obtenidos para
el patrón de quercetina y la muestra.
Figura 1. Espectros de la muestra por el método indirecto (a) y directo (b).
Los espectros para la muestra concuerdan con los obtenidos para los patrones (Figura 2, a y b).
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
284
Los espectros obtenidos mues-
tran una semejanza entre las longitu-
des de onda de máxima absorción
respecto a los patrones y muestras
evaluados por ambos métodos, lo que
posibilita que las condiciones espec-
trofotométricas evaluadas puedan ser
utilizadas para desarrollar técnicas
cuantitativas.
Análisis cuantitativo de flavo-
noides en hojas de Psidium guajava L.
La técnica consistió en cuantificar
espectrofotométricamente los flavo-
noides presentes en el extracto de las
hojas de Psidium guajava L., sobre la
base del patrón de quercetina.
Independientemente de que se
conoce que las longitudes de onda de
máxima absorción de los compuestos
orgánicos en diferentes disolventes
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
Figura 2. Espectro correspondiente al patrón de quercetina por el método
indirecto (a) y por el método directo (b).
puede sufrir variaciones, la falta de
concordancia de este parámetro en los
extractos obtenidos con los diferentes
disolventes empleados, por uno u otro
método de extracción, en compara-
ción con el patrón de quercetina en los
mismos disolventes, llevó a pensar
que la forma en la que se encontraba
el metabolito en los extractos podía
ser diferente, unas veces se podía estar
en presencia de la aglicona y otras del
glucósido. Es por eso que fue necesa-
rio someter la muestra a un proceso
extractivo que incluyera una hidrólisis
ácida. De esta manera se logró la
necesaria concordancia entre las
longitudes de onda de máxima absor-
ción de muestras y patrones al rom-
perse los enlaces glicosídicos.
Según el espectro registrado
(Figura 2), la longitud de onda de
Ortíz et al
285
máxima absorción de quercetina en
acetato de etilo fue 370 nm, por lo que
dicha longitud de onda deberá utili-
zarse para la determinación cuantitati-
va por el método ultravioleta directo.
Por otra parte, la longitud de onda de
máxima absorción del compuesto
coloreado formado a partir de querce-
tina y triocloruro de aluminio en
acetato de etilo es de 425 nm (Figuras
1 y 2).
Finalmente se las muestras se
analizaron por los dos métodos
(directo e indirecto) y la concentra-
ción promedio de flavonoides totales
(respecto a quercetina) por el método
directo fue de 1,018 ± 0,008 %, mien-
tras que por el método indirecto el
resultado fue 0,936 ± 0,008 %. La
diferencia significativa puede deberse
a la falta de especificidad más marca-
da en el intervalo ultravioleta.
Validación de los métodos
Linealidad
Método indirecto:
Al comparar los valores obte-
nidos para cada parámetro calculado a
partir de la curva de calibración
(Figura 3), con los criterios estableci-
dos (Eurachem, 1998; European Phar-
macopeia, 2016), se puede afirmar
que todos se encuentran dentro de los
intervalos especificados.
La ecuación de la recta obteni-
da para la quercetina patrón fue Y =
0,1195x – 0,0192 con un coeficiente
de correlación de 0,9966, un coefi-
ciente de variación de los factores
respuesta 3,73 % (inferior a 5,00 %) y
una desviación estándar relativa de la
pendiente de 0,001% (inferior a 2%.
Con el propósito de corroborar los
resultados anteriores se realizó un
análisis de varianza en el cual se
obtuvo un valor de F= 3853,04
(mucho mayor que el F crítico: 1,82 x
10-17), estadísticamente significativo.
Se pudo afirmar que el método desa-
rrollado fue lineal en el intervalo de
concentración evaluado.
Figura 3. Curva de calibración para quercetina patrón (compuesto coloreado).
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
286
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
Método directo:
La Figura 4 muestra la curva
de calibración. Todos los parámetros
se encuentran dentro del intervalo
especificado.
La ecuación de la recta
obtenida a partir del patrón de
quercetina fue Y= 0,0796x + 0,0003
con un coeficiente de correlación de
Precisión
Este parámetro incluye los
términos repetibilidad y precisión
intermedia. Para el primer caso la
técnica se repitió sin alterar las
condiciones, mientras que en el
segundo la técnica se desarrolló en
diferentes días. Este parámetro
también fue evaluado en ambos
Figura 4. Curva de calibración para el método directo.
0,9900, un coeficiente de variación de
los factores respuesta 4,3 % (inferior a
5%) y una desviación estándar
relativa de la pendiente de 0,002 %
(menor que 2%).
El valor de F de Fischer:
1425,29 obtenido (mucho mayor que
F crítico: 1,13 x 10-14) fue
estadísticamente significativo.
métodos tanto el directo como el
indirecto.
El coeficiente de variación
para una serie repetida de datos en
condiciones homogéneas no fue
nunca superior a 0,84% (≤1,5%), lo
cual indica una adecuada precisión en
términos de repetibilidad. Para la
precisión intermedia se obtuvo un
Ortíz et al
287
coeficiente de variación adecuado
nunca superior a 1,8% (≤ 3%).
Exactitud
La recuperación promedio fue
de 99,81 %. Se realizó una prueba
t-Student que permitió corroborar que
el recobrado obtenido no era
significativamente diferente de 100
%.
Los resultados anteriores se
corroboraron con las curvas de
recuperación (Figuras 5 y 6); el valor
de la pendiente corresponde con la
recuperación y es consistente con el
valor del recobrado promedio
anteriormente calculado. Esto
demuestra una elevada exactitud en
las determinaciones.
Límite de detección (LD) y de
cuantificación (LC).
Los valores más bajos se
lograron para el método directo.
Como LD se obtuvo un valor de 0,086
µg/mL y como LC 0,261 µg/mL; estos
valores se encuentran por debajo del
valor más bajo de concentración
evaluado en la técnica.
Especificidad
Los métodos aplicados fueron
inespecíficos, pues son determinacio-
nes espectrofotométricas, indepen-
dientemente de que se puede lograr
una mayor especificidad en la deter-
minación a través del método indirec-
to.
Con los resultados obtenidos
para los parámetros de desempeño se
puede afirmar que los métodos desa-
rrollados son fiables.
Conclusiones
Tanto el método espectrofotométrico
directo como el indirecto permiten la
cuantificación de flavonoides en hojas
de Psidium guajava L.
Figura 5. Curva de recuperación en la técnica de
espectrofotometría indirecta.
Figura 6. Curva de recuperación en la técnica de
espectrofotometría UV directa.
Desarrollo y Validación de Técnicas Espectrofotométricas
288
Revista Amazónica Ciencia y Tecnología Volumen 5 Nº3
Ambos métodos desarrollados
con confiables para la cuantificación
de flavonoides en hojas de Psidium
guajava L.
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